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使用沃特世超高效合相色谱分析短杆菌肽

日期:2013年4月17日 09:15

  短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质,被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素。用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大。因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性,而这些洗涤剂容易发生聚集或沉淀,严重影响它们的回收,这些因素及其他原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。在ACQUITY UPC2 TM系统上使用沃特世(Waters?)超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法,可得到线性和可重复的结果,测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%,是准确、高精度分析短杆菌肽的方法。

  沃特世解决方案:ACQUITY UPC2系统;ACQUITY? SQD;ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱;EmpowerTM 3软件。

  实 验

  除非另有说明,以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。

  1.UPC2测试条件

  UPC2系统: ACQUITY UPC2;检测器:PDA、ACQUITY SQD [email protected],分辨率为6nm(补偿400~500nm);色谱柱:ACQUITY UPC2 CSH氟苯基,3.0mmx100mm,1.7μm;柱温:50°C;样品温度:15°C;UPC2 ABPR: 1885psi;进样量:1μL;流速:2.0mL/min;流动相A:CO2;流动相B:含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示);梯度:20%~30%B,1.5min。

  2.SQD条件

  离子源:ES+;锥孔电压:20V;毛细管电压:3.7kV;源温度:150°C;脱溶剂气温度:500°C;脱溶剂气体流速:400L/hr;锥孔气体流速:25L/hr;SIR: 922.6,930.3,941.9。

  3.数据管理

  Empower 3软件。

  4.样品描述

  用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买,将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液,如需要,可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中,然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽,去除甲醇层,用0.2μm的烧结玻璃盘过滤,然后直接进样ACQUITY UPC2系统。

  结果与讨论

  我们系统性地筛选了4种色谱柱,测定哪种分离效果最佳,结果如图1所示,色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下,BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰,由于其他色谱柱表现出合适的色谱性能,因而未对这两者的非洗脱原因深入研究,其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳,因此采用该色谱柱继续研究。

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