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蛋白质、多肽液相色谱纯化方法介绍

日期:2013年2月18日 16:54

  蛋白质的分离纯化工作较为复杂,从细胞中提取的蛋白质或从含有蛋白质的溶液中经过沉淀、梯度离心、盐析等方法得到的蛋白质经常含有杂质,要去除这些杂质,同时又要保持蛋白质的生物学活性,如酶的催化活性,就需要根据不同的蛋白质制定出相应的策略,采用不同的方法。

  1、纯化的一般目标和方法

  首先,自然来源或者重组表达的蛋白质经过一些粗提的步骤(例如:匀浆、离心、硫酸铵沉淀等)成为稳定的可以用于色谱分离的样品。

  然后进行捕获色谱(capturechromatography),主要目标是浓缩和去除大量的容易去除的杂质,此步最关心的是流速和载量,常采用高载量、快流速凝胶。

  经过浓缩的部分纯化的样品进行中级色谱(intermediatechromatography),目的是去除较难去除的杂质,此步最关心的是分辨率,常采用高分辨率的细颗粒凝胶。

  最后为了得到符合要求的最终产品,去除残存的杂质以及目的蛋白的多聚物或者降解片断,进行精制色谱(polishingchromatography),常采用具有高分辨率的凝胶过滤凝胶进行凝胶过滤色谱。

  2、纯化前的准备工作

  (1)样品稳定性试验

  a、测定样品在pH2-9的稳定性;

  b、测定样品在0-4mol/LNaCl及0-2mol/L硫酸铵中的稳定性;

  c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性;

  d、测定样品在4-40℃的稳定性;

  e、室温下静置过夜,测定对蛋白水解酶的稳定性。

  (2)样品预处理

  a、去除样品中颗粒物(0.45-0.22微米膜过滤或者10000g离心15分钟)

  b、去除样品中脂类(10000g离心15分钟或有机溶剂抽提)

  c、去除样品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉淀)

  d、抑制样品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑制剂、低温下快速第一步分离或在蛋白酶缺陷宿主中表达重组蛋白)

  (3)样品的保存条件:

  短期储存(小于24小时)

  a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀

  b、在密闭容器中冰箱冷藏

  较长期储存(数天)

  a、b、同上

  c、加入适当的抑菌剂

  长期储存

  a、同上

  b、冰冻或者最好冻干(真空冷冻干燥)保存。

  3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立

  a、目的蛋白含量测定

  酶活性测定、生物活性测定、放射免疫、酶联免疫、免疫电泳、荧光。

  b、总蛋白含量测定

  紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料结合法(考马斯亮兰G-250)等。

  c、样品复杂度检测

  HPLC(离子交换、凝胶过滤、反相)、SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳(CE)。

  4、蛋白质的来源

  (1)天然蛋白:天然产物中的目的蛋白一般含量很少而且组分极复杂,在分离过程中须采用多个步骤才能去除各种杂质,并应在整个过程中降低蛋白水解酶的活性。

  (2)重组蛋白:重组蛋白则目标蛋白的丰度较高。重组蛋白主要有三种表达定位:

  a、细胞质:在这种情况下,必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质,同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放;在表达量较高的条件下,一般形成包涵体,包涵体含有过表达目的蛋白,且容易通过高速离心分离,但是包涵体的溶解与复性是较复杂的。

  b、外周质:表达的蛋白质存在于细菌内膜与外膜之间,这样目的蛋白可以较少地受到蛋白酶的作用并减少了宿主蛋白的污染。

  c、分泌到培养基:这种表达一般蛋白质浓度较低,主要受到培养基中的污染。

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